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一种高耐酒精型酵母菌的性能研究

摘要:以五粮液酒业的酒糟为样品,通过富集培养,从中分离出24株酵母菌株,经过三级筛选试验,最终获得了1株高耐酒精型酵母菌JZ1菌株,并对其生物学特性进行了研究。结果发现:菌株JZ1具有较高的耐葡萄糖和耐酒精能力,其最适生长pH值为5.0,最适培养温度为30℃,在培养30h内酵母菌的生长状况良好,发酵能力很强,本研究将为下一步的应用工作提供依据。论文发表
乙醇作为一种环保型可再生能源,已经广泛的应用于食品、燃料、化工等多个方面。目前,国内外的酒精行业正在快速的发展,如何能提高成熟醪的酒精浓度,不仅可以降低生产时的能耗,而且能提高设备利用率,因此,提高发酵醪酒精浓度受到国内外学者的高度重视[1-2]
酵母菌是酿酒工业主要微生物。在发酵过程中,酵母所产酒精含量达到一定浓度后则会对其自身产生毒害作用,当酒精度为4%Vol时,便会对一些酵母菌株的生长和发酵产生抑制作用。Guiliennond等研究发现,酵母属的各种间或同一种的各菌株间,对自身产生酒精耐受力的大小能够决定其发酵能力[3]。本研究采用自然选育的方法,从五粮液酒厂的酒糟中筛选出一株高耐酒精的酵母菌株,并对其生物学特性进行了研究,以期为下一步的应用工作提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
酒糟:由五粮液酒业提供。
1.1.2试剂
大豆蛋白胨、酵母浸膏:北京奥博星生物技术有限公司;葡萄糖:上海山浦化工有限公司;琼脂:广东环凯微生物科技有限公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC):成都百事兴科技实业有限公司;无水乙醇:国药集团化学试剂有限公司;以上实验所用试剂均为分析纯。
TTC上层培养基:琼脂1.5g、葡萄糖0.5g、TTC 0.05g、水100mL、115℃灭菌20min;
TTC下层培养基[4]:酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基;
YPD液体培养基:大豆蛋白胨10g、葡萄糖20g、酵母浸膏10g、水1000mL、115℃灭菌20min;
发酵培养基[5]:酵母浸膏10g,葡萄糖200g,硫酸铵1 g、大豆蛋白胨20g、水1000mL、115℃灭菌20min。
1.1.3仪器与设备
实验室pH计EL20:梅特勒托利多仪器(上海)有限公司;SE602F电子天平:奥豪斯仪器上海有限公司;系列生化培养箱THZ-98AB:昆山一恒仪器有限公司;752紫外可见分光光度计:上海佑科仪器仪表有限公司;PAL-1糖度仪:日本ATAGO公司;WZB数显折光仪:上海仪电物理光学仪器有限公司;电子天平AL204:梅特勒托利多仪器(上海)有限公司。
1.2实验方法
1.2.1酵母菌的富集及分离
取一定量酒糟至培养基中进行富集培养,之后再将菌液加至另一新鲜含酒精5%vol的培养基中,24h后稀释涂布,静置培养,分离纯化 [6]
1.2.2耐高酒精酵母菌株的筛选
(1)一级筛选(TTC产酒精试验):将分离得到的酵母菌株接种于TTC下层培养基中,30℃恒温培养24h后,将TTC上层培养基覆盖在TTC下层培养基上,继续培养2h,观察显色情况,显色情况越明显,颜色越深表示菌株的产酒精能力较强 [7]
(2)二级筛选(杜氏小管产气试验):将上一级挑选的酵母菌株,按照5%的接种量分别接种于带有杜氏小管的YPD液体培养基中,排尽小管中的气体,于30℃恒温培养箱中进行培养,分别在12 h、24h、36 h、48 h,观察并记录杜氏小管中的产气情况。
(3)三级筛选(试管发酵试验):将经过一、二级筛选所得菌株,按照5%的接种量分别接种于发酵培养基中,在30℃的条件下静置培养72h,测定各发酵液的二氧化碳失质量及残糖量,以此来衡量酵母菌株的发酵性能。
1.2.3 耐酒精酵母菌株的生物学特性研究
(1) 不同pH值试验:将所得的高耐酒精酵母菌株分别接种于不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的YPD液体培养基中,于30℃条件下恒温培养48h,在波长600nm处测定吸光度值。
(2)不同温度试验:将筛选所得高耐酒精酵母菌株分别接种于YPD液体培养基中,分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下恒温培养48h,在波长600nm处测定吸光度值。
(3)耐葡萄糖试验:将所得高耐酒精酵母菌株分别接种于不同浓度葡萄糖(10%、20%、30%、40%、50%)的YPD培养基上,取相同量置于杜氏小试管中,并于30℃条件下恒温培养48h,观察试管内产气情况,通过比较产气量分析菌株的耐葡萄糖性能[6]
(4) 耐乙醇试验:将菌株JZ1分别接种于酒精度为10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol的YPD液体培养基中,取相同量置于杜氏小试管中,并于30℃条件下恒温培养48h,观察试管内产气情况,通过比较产气量分析菌株的耐酒精性能[8]
(5)生长曲线:将所得高耐酒精酵母菌按照2%的接种量接种于YPD液体培养基中,并每间隔5h,在波长600nm处测定其定吸光度值,根据所测吸光度值,绘制高耐酒精酵母菌株的生长曲线图[9]
2结果与分析
2.1耐高酒精酵母的筛选
经过对样品的富集培养,从中挑选出具有典型特征的菌落,一共分离出24株酵母菌,经过TTC产酒精试验,比对各培养皿中的显色情况,从24株酵母菌株中共筛选出8株能力相对较强的菌株。再经过杜氏小管产气试验,筛选出了JZ1,JZ4,JZ5,JZ7共4株菌株,最后对这4种菌株进行酒精发酵试验,其结果如表1所示。
表1 菌株发酵性能情况
菌株编号 二氧化碳失重/g 残糖量/(mg/ml) 酒精度/%vol
36h 72h
JZ1 6.83 15.53 10.31 9.05
JZ4 6.32 13.98 12.52 8.32
JZ5 5.02 13.28 14.96 7.96
JZ7 5.24 13.65 13.03 8.13
由表1可知,在发酵36h后,JZ1号菌株CO2的失重量最大,表明JZ1号菌株的发酵速度最快,在发酵72h后,从残糖量和酒精浓度值可知JZ1号菌株的发酵能力最强,糖的利用率和酒精的产量在这四种菌株中都是最好的,下一步将把JZ1号菌株作为实验菌株,对其进行生物学特性研究。
2.2  JZ1酵母菌株的生物学特性研究
2.2.1 不同pH值对菌株生长的影响
将所得JZ1酵母菌株分别接种于不同pH值的YPD液体培养基中,培养48h后在波长600nm处测定吸光度值。其结果如图1所示。
一种高耐酒精型酵母菌的性能研究_论文发表








图1 不同pH下JZ1菌株的生长情况
由图1可知,菌液的吸光度值随pH的增大呈先上升后下降的趋势.当pH值为5.0时,吸光度值达到最大,表明此时酵母菌JZ1生长状况最好。因此,菌株JZ1的最适生长pH值为5.0。
2.2.2不同温度对菌株生长的影响
将所得的JZ1酵母菌株接种于YPD液体培养基中,分别置于不同温度的培养箱内,恒温培养48h后,在波长600nm处测定吸光度值。其结果如图2所示。
一种高耐酒精型酵母菌的性能研究_论文发表









图2 不同温度下JZ1菌株的生长情况
由图2可知,随着培养温度的增加,菌株JZ1菌液的吸光度值呈现先增加后下降的趋势,当培养温度为30℃时,菌液的吸光度值达到最大。因此,菌株JZ1最适的生长温度为30℃。
2.2.3 菌株JZ1耐葡萄糖试验
将菌株JZ1接种于不同葡萄糖含量的YPD培养基上,取相同量置于杜氏小试管中,并于30℃条件下恒温培养48h,观察试管内产气情况,通过比较产气量确定JZ1酵母菌的耐葡萄糖性能,结果如表2所示。
表2 JZ1的耐葡萄糖能力
菌种 葡萄糖浓度/%
10 20 30 40 50
JZ1 ++++ ++++ +++ ++ +
注:“+”表杜氏小试管内气体量的多少。
由表2可知,菌株JZ1在葡萄糖含量为10%、20%的YPD液体培养基上长势均良好;当葡萄糖含量>30%时,菌株JZ1的产气量开始下降,当葡萄糖含量为50%时,菌株JZ1仍旧存活,由此可知,菌株JZ1具有较高的耐葡萄糖能力。
2.2.4酵母菌JZ1耐乙醇性能研究
制备不同乙醇浓度的YPD培养基于杜氏小试管内,取相同接种量的JZ1菌株接入发酵培养基,恒温30℃培养48h后观察杜氏小试管中的产气量,结果如表3所示。
表3 JZ1的耐乙醇能力
菌种 乙醇浓度/%vol
10 12 14 16 18
JZ1 ++++ ++++ ++++ ++ +
注:“+”表杜氏小试管内气体量的多少。
由表3可知,菌株JZ1在乙醇浓度为10%-14%时,酵母菌生长良好,产气量很多,当乙醇浓度>14%时,菌株JZ1的长势开始下降,产气量开始减少,由此可知,菌株JZ1的耐乙醇能力较高。
2.2.5菌株JZ1的生长曲线试验
按实验方法对JZ1菌株进行生长分析,在不同时间下观察菌液的吸光度值,其结果见图3。
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图3 不同时间下JZ1菌株的生长情况
由图3可知,随着培养时间的延长,菌株JZ1菌液的吸光度值在第30h时达到最高;当培养时间大于30h后,菌株JZ1菌液的吸光度值开始下降,菌株慢慢进入衰亡期。
3结论
本研究通过对样品的富集培养和三级筛选从五粮液酒糟中筛选出了一株高耐受酒精的酵母菌株JZ1,并对其生物学特性进行了研究。结果发现,菌株JZ1具有较高的耐葡萄糖和耐酒精能力,其最适生长pH值为5.0,最适培养温度为30℃,在培养30h内酵母菌的生长状况良好,发酵能力很强,在酿造等行业有着巨大的潜在应用价值。
 

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